概述

随着社会的进步和人类健康需求的提高，人用疫苗研发和生产技术迅速发展，我国在疫苗研发技术和生产工艺的完善方面取得了长足进步。本文分别介绍了灭活病毒疫苗、多糖蛋白结合疫苗、基因工程疫苗规模化生产工艺和技术的现状及未来发展趋势。

疫苗对保障人民群众身体健康和国家生物安全发挥了巨大作用。我国实施计划免疫以来，传染病发病率和死亡率得到有效控制，成功消灭天花、脊髓灰质炎、新生儿破伤风。麻疹、腮腺炎、风疹、百日咳、白喉、破伤风、日本脑炎、流行性脑脊髓膜炎等儿童常见传染病发病率和死亡率下降95%以上，乙肝感染率下降到1%以下，具有巨大的社会效益和经济效益。

虽然我国疫苗产业取得了长足进步，但疫苗产业的自主创新能力、新产品转化、关键核心技术应用、规模化生产工艺和技术水平与发达国家相比还存在一定差距。而且随着全球经济一体化和社会的快速发展，抗生素滥用、大气污染等因素影响，传染病频繁高发，生物恐怖主义危害不断加剧，艾滋病、流感、登革热、手足口病、埃博拉等一些重大疾病和新发传染病仍然严重威胁着人类的生命健康。

第1部分

国内外灭活病毒疫苗生产工艺及技术

灭活病毒疫苗是通过化学、热或辐射处理纯化而成的，其主要优点是：比活病毒疫苗稳定、安全，不会发生因接种而引起的感染；虽被灭活，但仍能被机体免疫系统识别并产生有效的免疫反应；可用于免疫系统相对较弱的个体；稳定性好，无需冷冻，便于运输。其主要缺点是免疫原性较弱，一般需多次接种。目前市场上销售的灭活病毒疫苗主要有脊髓灰质炎灭活疫苗、甲肝灭活疫苗、流感病毒灭活疫苗、人用狂犬病灭活疫苗、日本脑炎灭活疫苗、出血热双价灭活疫苗等。

1.1

细胞基质及培养方法

目前国内外灭活病毒疫苗的细胞基质主要有人二倍体细胞、原代细胞、鸡胚细胞和Vero细胞。其中人二倍体细胞主要有2BS株、KMB-17株、WI-38株和MRC-5株。各种细胞特性各异，培养方法也不同。人二倍体细胞的传代比例和传代次数相对有限，不利于大规模细胞培养，对培养基和牛血清的质量要求较高。原代细胞主要有仓鼠肾细胞和沙鼠肾细胞，操作繁琐，存在外源因素污染的风险。人二倍体细胞和原代细胞的培养方法主要有转瓶法和细胞工厂法。这两种培养方法比较传统，每批培养体积小，费时费力，生产规模也仅仅是增加转瓶或细胞工厂的数量基因工程技术，难以规模化。

Vero细胞是第一种能够连续增殖的哺乳动物细胞，来源于非洲绿猴肾细胞，目前广泛应用于疫苗生产，是灭活病毒疫苗的常用细胞基质。国内外Vero细胞培养主要采用微载体生物反应器。与细胞工厂培养相比，微载体生物反应器培养具有明显的优势：可进行高密度培养；在规定的细胞代限内进行细胞分级扩增，易于放大。国外公司已在8周内建立了从1mL安瓿瓶到6000L生物反应器的Vero细胞放大生产工艺流程。整个放大过程中，Vero细胞的产量和活性不降低[2]。

正是由于Vero细胞在病毒疫苗生产中的应用，现代病毒疫苗生产才进入了工业化、规模化时代，生产过程更加可控，批次一致性更好。目前国内外主流的以Vero细胞为基础的疫苗生产均采用微载体生物反应器培养技术。

利用Vero细胞为基质生产的灭活病毒疫苗主要有脊髓灰质炎灭活疫苗、狂犬病灭活疫苗、日本脑炎灭活疫苗等。目前，Vero细胞还用于生产小儿轮状病毒活疫苗（默克）和（葛兰素史克）[3]、H5N1流感疫苗（）[4]、日本脑炎疫苗（）[2]。此外，Vero细胞还被批准用于生产天花活疫苗（）[2]。

Vero细胞等细胞培养均采用血清培养，但含血清培养对病毒疫苗下游纯化也有较高的要求，需要严格控制血清中BSA含量、纯化回收率等一些关键指标。因此无血清细胞培养技术已成为国内外细胞培养研究的热点之一。Vero细胞研究的另一个热点是进行高密度细胞悬浮培养。与使用微载体不同，悬浮培养后细胞黏附性质发生变化，细胞不需消化即可直接传代，可提高细胞的发酵密度。

1.2

生产流程

国内外灭活病毒疫苗需经过收获、澄清、浓缩、纯化、灭活等生产工序。其中纯化主要采用柱层析或蔗糖密度梯度离心法。这两种方法各有优缺点：层析法便于线性扩增，批次一致性好，但试剂成本高；蔗糖密度梯度离心法纯化的抗原成分单一，能有效区分空心和实心病毒颗粒，但每批处理量较少，后期需除糖。国内外上市的灭活病毒疫苗大多采用层析纯化技术。

目前用于病毒灭活的两种主要灭活剂是β-丙内酯和甲醛。β-丙内酯常温下为无色粘稠液体，主要通过作用于病毒RNA来灭活病毒。目前上市的疫苗中，使用β-丙内酯灭活的主要是狂犬疫苗和双价肾出血热灭活疫苗。

在疫苗研究早期，人们曾使用甲醛灭活细菌和病毒疫苗。甲醛对病毒核酸和蛋白质都有破坏作用。甲醛对单链核酸的破坏作用最强，因此常用于灭活RNA病毒。脊髓灰质炎灭活疫苗、甲肝灭活疫苗、流感病毒灭活疫苗、日本脑炎灭活疫苗等均采用甲醛灭活技术。

1.3

质量控制

灭活病毒疫苗的主要控制指标是病毒抗原活性成分、纯度以及宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白（HCP）、灭活剂等残留成分。纯度检测主要方法有HPLC、SDS-PAGE或比活度等。其中，不同疫苗对Vero细胞残留DNA含量的要求并不统一。WHO生物标准化委员会在评估残留DNA引起转化事件的风险后认为，注射剂产品DNA含量小于10ng/剂即可接受[5]。目前，国产狂犬疫苗Vero细胞残留DNA含量标准为不超过100pg/剂，但美国上市的IPV（IPOL®）中Vero细胞残留DNA含量为不超过10pg/剂，我国上市的sIPV DNA含量为不超过50pg/剂，Vero细胞HCP含量一般不超过50ng/剂。

第2部分

基因工程疫苗规模化生产技术与工艺

基因工程疫苗是指利用DNA重组技术改造病原微生物基因组，降低其致病性、提高其免疫原性；或将病原微生物基因组中一个或多个编码保护性抗原的基因片段克隆到表达载体中，通过原核或真核表达系统诱导外源蛋白表达，经纯化等工艺步骤制成疫苗，接种动物使其产生保护性抗体，达到预防和治疗传染病的目的。近年来，随着分子生物学、反向遗传学、结构生物学等理论研究和技术方法的不断突破，以及专业仪器的不断更新换代，基因工程疫苗的进展也日新月异。目前，利用基因工程技术已经使用和正在研制的新型疫苗主要有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、转基因植物疫苗等，这些疫苗统称为基因工程疫苗。 与传统疫苗相比，基因工程疫苗具有以下优势：①抗原组成明确，表达途径清晰可控，安全性高；②生产成本低，工艺步骤稳定，易于规模化生产；③质控方法和标准具有一定的普适性，从而提高安全性；④通过载体或抗原蛋白的上游设计，可以构建针对多种疾病进行保护的多价疫苗。如今基因工程疫苗已经成为生物制品行业发展的一种趋势，在各类疾病的防控中发挥着重要作用。

基因工程疫苗的生产工艺流程包括上游保护性抗原/表位及表达载体设计、基因工程菌/细胞构建、大规模发酵培养、目的蛋白纯化四个步骤。基因工程蛋白研发和规模化生产的准入门槛较高，尤其是建立产业化规模化生产平台，需要多年的技术、人才和资金积累。其中，高表达工程菌/细胞株构建及下游生产纯化工艺是关键技术[14]。以提高单位产品产量、高密度细胞培养与表达[15]、简化生产流程、降低生产成本、保证规模化生产产品质量为目标的核心工艺开发已成为各大生物技术公司竞相开展的前沿课题。

2.1

质量控制

国际上一些知名疫苗生产企业在基因工程疫苗制备方面已逐步走向工艺规模化、自动化、一次制备阶段。工艺规模化在一定程度上体现了制造工艺的先进性和稳定性，在大大降低疫苗产品成本的同时，也降低了疫苗批次间质量差异的风险。大规模培养是常规疫苗生产领域的主要技术，目前国际主流培养规模为3000～8000L，多采用分批或分批添加培养，配以计算机二级控制，实现全自动化[16]。近年来，针对不同宿主细胞和疫苗产品生产工艺的特点，疫苗生产对个性化细胞培养基的需求不断增加，市场供需趋于规范化。自动化是规模化生产的目标和趋势，即采用自动化分离纯化系统，包括细胞破碎、微滤、超滤和层析技术等。 与此同时，整体柱、移动式模拟床层析、膜层析等新兴技术也逐渐应用于规模化生产。自动化的优势在于降低人工成本、提高效率，减少生产过程中人为操作失误和污染风险。一次性产品包括在大规模生产过程中与产品接触的设备、仪器和耗材，它们的应用可以使产品质量可控、易于验证。一次性细胞培养反应器已发展成为生物制药（包括疫苗）生产的主要形式，它的发展对于降低疫苗生产成本、提高经济效益、保证产品安全具有重要意义。国外疫苗生产厂家往往采用“个性化”服务方式，与某些公司合作，建立“合同服务”业务关系，通过模块化、平台化运作，开发最适合自身产品特点的个性化技术，应用于生产实践。厂家为客户提供最优化的技术服务和相关技术支持，如定制培养基、定制层析介质等，帮助客户提高生产能力，实现生产效率的大幅提升[16]。 大规模自动化、多参数系统化疫苗生产技术平台为提高疫苗生产效率、生产工艺的一致性、疫苗质量的稳定性提供了保障。

2.2

国内基因工程疫苗规模化生产工艺及技术

我国生物制药企业起步于20世纪80年代初，经过30年的努力，生物制药产业取得了一定的发展，生物产业初具规模，在发展中国家中处于较高水平。但我国疫苗大规模生产工艺研究起步较晚，大多处于半自动化阶段。根本原因是研发人员对“科研生产意识”和“质量源于设计”等理念的认识存在差距，导致初期研发设计与大规模生产制备脱节。临床前研究很少考虑工艺的可扩展性和最终产品质量的可控性。制备工艺往往局限于实验室规模，不适用于大规模生产。例如在纯化工艺中，超速离心和亲和层析在实验室研究阶段被广泛应用，均为间歇操作，且价格昂贵，难以应用于生产。

随着国外疫苗研发生产企业在华普遍建厂生产和国内疫苗质量控制与监管体系的不断完善，这方面的差距正在逐步缩小。另外，在疫苗生产的表达体系和宿主细胞方面，国外研发机构通常有专利技术保护，技术储备相对成熟；在规模化生产的仪器设备方面，无论是高密度发酵的生物反应器，还是大规模分离纯化的层析介质、膜分离技术[17]，关键仪器设备几乎全部依赖进口，极大地制约了我国疫苗规模化研制的进展。

基因工程疫苗领域的重点在上游设计，在疫苗研发前期就综合考虑工艺放大的可行性、质量可控性甚至厂房设备的需求，从而快速实现规模化生产占领市场，同时降低生产成本、提高生产效率、保证安全。因此，相较于传统疫苗，我国基因工程疫苗在产业化能力上更有可能与国际接轨。

第三部分

未来发展趋势及前景

3.1

灭活病毒疫苗技术及工艺发展趋势

灭活病毒疫苗技术与工艺的发展趋势主要体现在以下几点：进一步提高产业化和规模化，微载体生物反应器更大规模，高密度发酵工艺参数优化等；研究新型细胞基质，进一步提高细胞基质的安全性和培养浓度；优化细胞和病毒培养基，包括研究无动物源的培养基配方等；进一步改进纯化技术，最大限度提高目标抗原的纯度和比活；利用反向遗传学等技术改造菌株用于疫苗生产。

3.2

多糖蛋白结合疫苗技术及工艺发展趋势

我们采用符合欧盟标准的原料多糖，并在此基础上将原料多糖中的C多糖、残留蛋白及核酸含量控制在1%以下。载体蛋白采用精制后进一步纯化的TT，TT单体含量达到90%。我们采用基质辅助激光解吸-飞行时间（MALDI-TOF）质谱技术，检测蛋白的准确分子量及单体含量。通过这些技术研发，结合效率提高到30%~40%，并建立了新的工艺质控方法和临床效果评价方法，达到国际标准。

3.3

基因工程疫苗技术及工艺发展趋势

目前，以基因工程产品为主导的基因工程应用产业已成为全球增长最快的产业之一，发展前景广阔。基因工程产品主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核苷酸药物等，在防治人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各类传染病、类风湿性疾病等方面发挥着重要作用。在很多领域，特别是在疑难疾病方面，基因工程产品发挥着传统化学药物无法达到的作用。

我国生物医药市场​​将成为继美国之后全球第二大生物医药市场​​，预计基于10年的创新发展，基因工程疫苗行业将迎来最好的时期。与此同时，基因工程疫苗产业化也面临不小的挑战，由于我国在规模上长期以仿制为主，没有形成具有技术优势的领域，不能发挥技术的累积效应，制约了具有自主知识产权的产品研发。因此，面对国际新药研发进程的精细化、精准化，拥有自主知识产权，依托创新平台技术研发产品是基因工程疫苗规模化生产的重中之重。平台技术的延续与创新将为更多基因工程疫苗的研发提供更为广阔的发展空间。

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撰稿人：余晓晖、李启明、李秀玲、沈蓉、张爱华、张云涛